La región de Madidi estuvo habitada por diversos grupos culturales de habla tacana: toromonas, araonas, ixiamas, tacanas, cavinas, esse ejjas, uchupiamonas, eparamonas y pamainos. También compartieron el territorio comunidades de origen leco. La caza fue considerada una actividad primordial en el desarrollo material y espiritual de su cultura. Cultivaban la yuca, el maní, el frijol y el maíz; pescaban y recolectaban miel y una gran variedad de frutas. Utilizaban los ejes fluviales y caminos acondicionados para su transporte e intercambio comercial.

Los yacimientos arqueológicos de Madidi descubren la historia y el patrimonio cultural de los pueblos que habitaron esta región desde la época prehispánica. Se han encontrado sitios habitacionales y funerarios, caminos empedrados, piezas de cerámica de estilo amazónico, petroglifos. Recientemente, se han documentado 46 grabados rupestres en 10 sitios ubicados en el curso principal del río Beni, con representaciones de figuras humanas, de animales (monos, aves, serpientes), antropomorfas, zoomorfas y abstractas (espirales, círculos, líneas onduladas), que se relacionan con la cosmovisión de los antiguos habitantes de la región.

Si bien las concepciones del mundo de los pueblos indígenas y sus sistemas de gobernanza y producción han sido afectadas y transformadas a lo largo de su historia y por el contacto con otros pueblos, los rasgos esenciales de su cultura aún perviven y se expresan en sus tradiciones y su cosmovisión.

Actualmente, en Madidi se encuentran establecidas 31 comunidades de origen tacana, leco y quechua, con una población próxima a los 4.000 habitantes. El área protegida se superpone íntegramente con la TCO Uchupiamonas y parcialmente con las TCO Tacana I, Lecos de Apolo y Lecos de Larecaja. En su zona de influencia se ubican las TCO Tacana II y Araona. Estas características culturales son una de las fortalezas de Madidi, ya que forma parte del territorio ancestral de los pueblos tacana y leco. Sus experiencias de gestión territorial contribuyen a la protección de bosques íntegros y al mantenimiento de corredores biológicos vitales para la fauna silvestre. Revalorizan saberes tradicionales que aseguran el manejo sostenible de los recursos naturales.